Hallet, BernardYe, ShanyShanyYe2025-05-142025-05-142025-05-142024https://hdl.handle.net/2078.2/41122Les transposons sont des éléments génétiques délimités capables de se déplacer au sein et entre les génomes. Le déplacement de ces séquences génétiques est réalisé au sein d’un complexe nucléoprotéique, appelé le transpososome, et regroupe la transposase, les extrémités du transposon ainsi que l’ADN cible dans lequel viendra s’insérer le transposon. Parmi ces éléments génétiques mobiles, la famille de transposons réplicatifs Tn3 est largement répandue au sein des phyla bactériens et est connue pour son implication dans la dissémination de résistances aux antibiotiques. Le transposon Tn4430 a été choisi pour représenter cette famille. Des expériences in vivo et in vitro ont permis de mettre en lumière un modèle de transposition appelé « Replication Hijacking », où l'insertion du transposon a lieu en face d’une fourche de réplication. Récemment, des recherches in vitro ont révélé que la transposase est capable de former deux types complexes distincts avec les extrémités du transposon : le Single End Complex (SEC) et le Paired End Complex (PEC). Ces derniers présentent des activités différentes et sont préférentiellement formés par différents variants de la transposase. Le SEC, majoritairement formé par la transposase sauvage (TnpAWT), est associé à une faible activité, tandis que le PEC, formé principalement par les transposases hyperactives (TnpAS911R et TnpA3X), présente une activité de coupure élevée. Malgré la connaissance de ces deux complexes, le complexe ternaire n’a pas encore pu être isolé et caractérisé. Ce dernier comprend la transposase, l’ADN cible et les extrémités du transposon toujours liées au donneur, représentant ainsi le complexe clé dans lequel se déroule l’événement de transposition. Cependant, des études ont montré que le produit hypothétique de transfert de brin (STP2) est lié par la transposase mais ensuite désintégré. Cette observation suggère donc la présence d'un complexe similaire au complexe ternaire formé lors de la désintégration, suscitant ainsi un intérêt pour l'étude de ce complexe de « désintégration ». L'objectif de cette recherche est d'utiliser la désintégration comme un moyen de mieux comprendre l'intégration. À cette fin, le complexe de désintégration est étudié et caractérisé par EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays). Le but est de former et d'isoler ce complexe, puis de le comparer à d'autres complexes formés par la transposase afin de déterminer son affinité pour différents substrats en calculant la constante de dissociation à l'équilibre (KD). Un autre objectif est la mise en place d’une méthode standardisée pour quantifier et évaluer cette affinité. Nos résultats confirment que la transposase hyperactive TnpAS911R a tendance à former du PEC, tandis que la transposase sauvage forme principalement du SEC. De plus, l'affinité de la transposase pour son substrat augmente dans l'ordre des substrats rencontrés lors de l'intégration, suggérant la formation de complexes de plus en plus stables empêchant ainsi la réversion de la réaction. Cette recherche a également permis de mettre en place un système rapide pour quantifier l'affinité de la transposase pour ses substrats pouvant être utilisé dans des études futures. Transposons are delimited genetic elements capable of moving within and between genomes. The movement of these genetic sequences occurs within a nucleoprotein complex, called the transpososome, which includes the transposase, the transposon ends and the target DNA into which the transposon will insert. Among these mobile genetic elements, the family of replicative transposons Tn3 is widespread among bacterial phyla and is known for its involvement in the dissemination of antibiotic resistance. The transposon Tn4430 has been chosen to represent this family. Both in vivo and vitro experiments have highlighted a « Replication Hijacking » model of transposition, according to which transposase-mediated transposon insertion occurs in front of a replication fork. Recently, in vitro research has revealed that the transposase is capable of forming two distinct complexes with the transposon ends : the Single End Complex (SEC) and the Paired End Complex (PEC). These complexes exhibit different activities and are preferentially formed depending on transposase variants. The SEC, mostly formed by wild-type transposase (TnpAWT), is associated with low activity; while the PEC, primarily formed by hyperactive transposases (TnpAS911R and TnpA3X), displays high cleavage activity. However, the ternary complex has not yet been isolated and characterized. This complex includes the transposase, the target DNA, and the transposon end still bound to the donor, thus representing a key complex in which the transposition will occur. However, studies have shown that the hypothetical strand transfer product (STP2) can be bound by the transposase but is subsequently disintegrated. This observation suggests the presence of a complex similar to the ternary complex that is formed during disintegration, thus sparking interest in studying this « disintegration » complex. The aim of this research is to use disintegration as a proxy to better understand integration. To this end, the disintegration complex is studied and characterized by Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA). The goal is to form and isolate this complex, then compare it to other complexes formed by the transposase to determine its affinity for different substrates by calculating the equilibrium dissociation constant (KD). Another objective is to establish a standardized method for quantifying and evaluating this affinity. Our results confirm that the hyperactive transposase TnpAS911R tends to form PEC, while the wild-type transposase primarily forms SEC. Additionally, the transposase's affinity for its substrate increases in the order of substrates encountered during integration, suggesting the formation of increasingly stable complexes, thus preventing reaction reversion. This research has also facilitated the development of a rapid system for quantifying the transposase's affinity for its substrates, which could be utilized in future studies.Tn4430TransposonTransposaseTnpATn3EMSAtext::thesis::master thesisthesis:47476