Régulation du système de quorum sensing ScuR-SarF chez Streptococcus salivarius HSISS4

Details

Supervisors

Hols, Pascal ; Cerckel, Guillaume

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire, à finalité approfondie

Abstract

L'utilisation intensive des antibiotiques a conduit à l'émergence du problème d‘antibiorésistance. Si rien ne change, les infections par des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques pourraient devenir la principale cause de décès dans le monde d'ici 2050. Pour ces raisons, il est impératif de trouver des alternatives aux antibiotiques. Les peptides antibactériens, appelés bactériocines, semblent être une voie prometteuse. Streptococcus salivarius HSISS4 secrète des bactériocines dont la production est couplée à la compétence pour la transformation d’ADN et est régulée par le senseur à phéromone ComR. Ce couplage permet à S. salivarius de tuer les bactéries environnantes, provoquant ainsi une libération d'ADN dans l'environnement extracellulaire/ Cet ADN est ensuite capturé et incorporé dans le génome par mécanisme de transformation naturelle. L'équipe du Pr. Hols et ses collaborateurs ont identifié deux protéines paralogues de ComR: ScuR et SarF, dont l’étude a montré que ScuR induit les gènes de bactériocines et du transporteur SptAB, alors que SarF n'induit que le transporteur. La protéine ScuR permet donc de découpler la production de bactériocines du déclenchement de la compétence, offrant ainsi des perspectives pour l’utilisation de S. salivarius comme probiotique à des fins thérapeutiques. Récemment, un criblage de mutations spontanées a permis de sélectionner 10 clones présentant une forte activation du promoteur sptA (PsptA) activé par les protéines ScuR et SarF, suggérant des mutations affectant la régulation génique ou l’activation de ces deux régulateurs. L’objectif de mon mémoire a consisté à la caractérisation de ces mutants afin de mieux comprendre les bases moléculaires de l’activation du système ScuR-SarF. Afin de valider l’implication spécifique de ScuR et SarF, la première partie du travail s'est focalisée sur la caractérisation des 10 clones issus du criblage. Nous avons créé des mutants de délétion des gènes comR, scuR, sarF et scuR-sarF. Nous avons observé que les mutants de délétion de scuR, de sarF et de scuR-sarF présentaient dans la plupart des clones une diminution de l’activation de PsptA mais avec des variations inter-clonales importantes, suggérant des mutations différentes. Ensuite, l'analyse post-séquençage des génomes des 10 clones nous a permis la mise en évidence de 3 gènes candidats potentiellement impliqués dans la régulation de l'activité de PsptA : pepC, malQ et manL2. En effet, 7 clones présentaient une mutation dans pepC, 2 clones une mutation dans malQ et un clone une mutation dans manL2. Enfin, nous avons transféré individuellement les mutations des 3 gènes dans la souche rapportrice qui a été utilisée dans le crible afin de confirmer le rôle de la mutation sur l'activation de PsptA, PslvX (promoteur des bactériocines) et PcomX (promoteur du régulateur principal de compétence). Les souches construites ont montré une forte activation de PsptA, une activation modérée de PslvX et une très faible activation de PcomX. Ceci suggère que les mutations influencent dans une large mesure le système responsable de l’activation de PsptA. Nous avons donc confirmé que les mutations provoquaient les profils observés dans les tests d'activation de PsptA dans les clones initiaux issus de criblage. Ce travail offre des perspectives intéressantes dans la compréhension de la régulation du système de communication intercellulaire ScuR-SarF et dans la découverte des acteurs moléculaires impliqués. The intensive use of antibiotics has led to the emergence of the antibiotic resistance crisis. If nothing changes, infections with multi-drug resistant bacteria could become the leading cause of death worldwide by 2050. For these reasons, it is imperative to find alternative therapies to antibiotics. Antibacterial peptides, named bacteriocins, appear to be a promising approach. Streptococcus salivarius HSISS4 secretes bacteriocins, which are coupled to competence for DNA transformation and regulated by the ComR pheromone sensor. This coupling mechanism allows S. salivarius HSISS4 to eliminate surrounding bacteria, triggering a release of DNA into the extracellular environment. DNA is then captured and incorporated in the genome of surrounding bacteria by the natural transformation mechanism. The activation of this process is toxic for bacteria and is therefore finely regulated. Few years ago, the team of Prof. Hols and his collaborators identified two ComR paralogs: ScuR and SarF. ScuR induces the production of bacteriocins and SptAB transporter, while SarF only induces SptAB. The ScuR protein uncouples bacteriocin production of triggering competence, opening up the possibility of using S. salivarius as a potential probiotic for novel therapeutical purposes. More recently, a genetic screening of the ScuR-SarF system allowed the selection of 10 clones showing a strong activation of the sptA promoter (PsptA) activated by ScuR and SarF regulators. This suggests that some mutations interfere with the ScuR-SarF regulation system. The aim of my Master thesis was to characterize these 10 mutants in order to better understand the molecular basis of the regulation of the ScuR-SarF system. The first part of the work focused on the characterization of the 10 isolated clones. I generated deletion mutant strains for comR, scuR, sarF, and scuR-sarF genes. I observed that scuR, sarF and scuR-sarF deletions showed a decrease in PsptA activation but with inter-clonal variations, suggesting that the mutations were different. The second part of my thesis was devoted to the post-sequencing analysis of the whole genomes of the 10 clones. I identified 3 candidate genes involved in the regulation of PsptA activity: pepC, malQ, and manL2. Indeed, 7 clones showed a mutation in pepC, 2 clones had a mutation in malQ and one clone had a mutation in manL2. Finally, I transferred the mutations of pepC, malQ, and manL2 individually into the reporter strain that was used in the genetic screen in order to confirm their role in the activation of PsptA, PslvX (bacteriocin promoter) and PcomX (promoter of the master competence regulator) promoters. The constructed strains showed strong activation of PsptA, moderate activation of PslvX, and very weak activation of PcomX. This suggests that the mutations influence to a large extent the system responsible of PsptA activation. We therefore confirmed that mutations cause the patterns observed in PsptA activation assays in the initial clones from screening. This work provides interesting insights into the regulation of the ScuR-SarF intercellular communication system and the discovery of some molecular players.