Caractérisation des homologues de la lactate racémase chez Clostridium asparagiforme et Clostridium pasteurianum

Details

Supervisors

Desguin, Benoît ; Hols, Pascal

Faculty

Faculté des bioingénieurs

Degree label

Master [120] : bioingénieur en chimie et bioindustries, à finalité spécialisée

Abstract

Dans la famille des racémases et des épimérases agissant sur les acides α-hydroxylés (EC 5.1.2), seules deux enzymes avaient été identifiées jusqu’à récemment : la lactate racémase (LarA) et la mandélate racémase. Pour son activité, LarA utilise le cofacteur Nucléotide Pince à Nickel (NPN). Cette découverte a mené à l’identification d’une nouvelle superfamille d’enzymes NPN-dépendantes correspondant aux homologues de LarA (LarAHs). Les LarAHs ont la capacité de racémiser ou épimériser des acides α-hydroxylés (AHAs) autres que le lactate. Au total, plus de 354 LarAHs ont été répertoriés et catégorisés en 25 groupes phylogénétiques distincts, catalysant potentiellement des réactions différentes. Avant ce mémoire, 7 LarAHs catalysant 5 nouvelles activités d’isomérisation d’AHAs avaient été caractérisés : deux malate racémases, une α-hydroxisocaproate racémase, deux gluconate épimérases, une α-hydroxyglutarate racémase et une phényllactate racémase. L’objectif de ce mémoire est de progresser dans l’étude et la caractérisation de nouvelles activités de racémisation et d’épimérisation d’AHAs catalysées par les LarAHs de deux espèces du genre Clostridium: C. asparagiforme et C. pasteurianum. Ces LarAHs sont nommés respectivement CLAS1 à 9 et CLOP1 à 3. A cette fin, deux approches sont utilisées parallèlement : l’étude in vitro et l’étude in vivo. Des tests d’activités ont été réalisés in vitro grâce à l’électrophorèse capillaire afin de déterminer les substrats sur lesquels étaient actifs les 7 CLAS et les 2 CLOP solubles. De nombreuses nouvelles activités ont été détectées, particulièrement pour CLAS1 et CLAS4 qui appartiennent au même groupe phylogénétique et qui sont actifs sur une large gamme d’AHAs. La racémisation du L-malate par CLAS1 et du L-lactate par CLOP1 a été caractérisée biochimiquement par dosage spectrophotométrique. Pour étudier le rôle in vivo des CLAS et des CLOP, des plasmides pCBEclos ont été construits avec succès pour les 3 CLOP et 6 CLAS. Ces plasmides devraient permettre d’inactiver spécifiquement les gènes clas et clop grâce au système CRISPR Cas9D10A. Dans le but de pouvoir, à terme, transformer les plasmides pCBEclos chez C. asparagiforme, différents essais de transformation ont été effectués avec des plasmides navettes pMTL mais ceux-ci se sont avérés non concluants. Ces résultats peuvent être expliqués par l’identification inattendue de 8 systèmes de modification-restriction chez C. asparagiforme.