Étude de l'impact du stress oxydatif sur le mécanisme d'allongement alternatif des télomères

Details

Supervisors

Decottignies, Anabelle

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire, à finalité approfondie

Abstract

Les télomères sont des séquences répétées riches en guanine localisées aux extrémités des chromosomes protégeant l’intégrité génomique. Ces séquences se raccourcissent à chaque cycle cellulaire et lorsque les télomères atteignent une longueur critique, la cellule arrête de se diviser. Cependant, les cellules cancéreuses contournent cette barrière antiproliférative en compensant le raccourcissement des télomères à l’aide de la télomérase, une transcriptase qui ajoute des nucléotides aux extrémités télomériques ou bien en allongeant les extrémités des chromosomes à l’aide d’un mécanisme alternatif de maintien des télomères (ALT) qui est basé sur la recombinaison homologue, et plus précisément la voie de réplication induite par cassure (Break-Induced Replication, BIR). Bien qu’il soit connu qu’une cassure d’ADN double-brin (CDB) est requise pour induire l’activation du mécanisme ALT aux télomères, l’origine de cette cassure reste encore incomprise. Une hypothèse de l’équipe est que le stress oxydatif, en causant des dommages aux télomères, pourrait induire le mécanisme ALT. L'objectif de ce mémoire était donc d'étudier les mécanismes sous-jacents à l'activation du mécanisme alternatif d'allongement des télomères (ALT) en testant un potentiel rôle du stress oxydatif dans la formation des cassures d’ADN double-brin , essentielles à l'activation de l'ALT. La première partie de l'étude a porté sur l’analyse de l'expression des gènes impliqués dans le stress oxydatif et la réparation des bases oxydées afin de déterminer si les cellules ALT+ présentent un stress oxydatif plus élevé, une défaillance dans la défense antioxydante ou des défauts dans la réparation des lésions oxydatives de l'ADN. L'analyse par séquençage ARN (séq-ARN) des lignées cellulaires ALT+ et TEL+ n'a pas révélé de différences significatives dans l'expression des gènes liés au stress oxydatif. Cependant, le gène OGG1, une glycosylase impliquée dans la réparation des dommages oxydatifs (8-oxoG), était plus exprimé dans les cellules ALT+, ce qui suggère un lien possible entre les lésions oxydatives au niveau des télomères et l'activation de la voie ALT. La deuxième partie de l'étude a permis d’examiner l'impact de la réduction du stress oxydatif sur les mécanismes ALT, en utilisant des lignées de sarcomes Rho0 (déplétées de leur ADN mitochondrial). Les résultats ont montré que la survie des cellules ALT+ dépendant plus fortement de l'ADN mitochondrial que celle des cellules TEL+, suggérant une dépendance des cellules ALT+ à la production de ROS . Ces résultats sont soutenus par l’observation similaire effectuée sur des lignées ALT+ traitées avec un antioxydant. De manière surprenante, la déplétion de l'ADN mitochondrial ou le traitement avec un antioxydant , a entraîné une élévation des marqueurs ALT, suggérant une activité accrue de l’activité ALT. Ces résultats ont remis en question l'hypothèse initiale selon laquelle la réduction du stress oxydatif inhiberait l'activité ALT. Néanmoins, une nouvelle hypothèse a émergé où la diminution de production de ROS pourrait entrainer une élévation du stress réplicatif aux télomères, qui se traduirait par une augmentation de marqueurs ALT qui reflètent le stress réplicatif télomérique. Des expériences supplémentaires sont nécessaires afin de confirmer les nouvelles hypothèses, mais cette étude apporte de nouveaux éléments pour la compréhension du mécanisme ALT. Telomeres are guanine-rich repeated sequences located at the ends of chromosomes, protecting genomic integrity. These sequences shorten with each cell cycle, and when telomeres reach a critical length, the cell stops dividing. However, cancer cells bypass this anti-proliferative barrier by compensating for telomere shortening using telomerase, a reverse transcriptase that adds nucleotides to telomeric ends, or by elongating chromosome ends through an alternative lengthening of telomeres (ALT) mechanism. This mechanism is based on homologous recombination, specifically the break-induced replication (BIR) pathway. While it is known that a double-strand DNA break (DSB) is required to activate the ALT mechanism at telomeres, the origin of this break remains unclear. One hypothesis proposed by the team is that oxidative stress, by causing damage to telomeres, could induce the ALT mechanism. The objective of this thesis was therefore to study the mechanisms underlying the activation of the ALT mechanism by testing a potential role of oxidative stress in the formation of DSBs, which are essential for ALT activation. The first part of the study focused on analyzing the expression of genes involved in oxidative stress and the repair of oxidized bases to determine whether ALT+ cells exhibit higher oxidative stress, deficiencies in antioxidant defense, or defects in repairing oxidative DNA lesions. RNA sequencing (RNA-seq) analysis of ALT+ and TEL+ cell lines did not reveal significant differences in the expression of oxidative stress-related genes. However, the OGG1 gene, a glycosylase involved in the repair of oxidative damage (8-oxoG), was more highly expressed in ALT+ cells, suggesting a possible link between oxidative damage at telomeres and ALT pathway activation. The second part of the study examined the impact of reducing oxidative stress on ALT mechanisms using Rho0 sarcoma cell lines (depleted of mitochondrial DNA). The results showed that the survival of ALT+ cells depended more heavily on mitochondrial DNA than TEL+ cells, suggesting a reliance of ALT+ cells on ROS production. These findings were supported by similar observations in ALT+ cell lines treated with an antioxidant. Surprisingly, mitochondrial DNA depletion or antioxidant treatment led to an increase in ALT markers, indicating heightened ALT activity. These results challenged the initial hypothesis that reducing oxidative stress would inhibit ALT activity. Nevertheless, a new hypothesis emerged, suggesting that a decrease in ROS production could lead to increased replicative stress at telomeres, reflected by an elevation in ALT markers indicating telomeric replicative stress. Additional experiments are needed to confirm these new hypotheses, but this study provides new insights into the understanding of the ALT mechanism.