Caractérisation des bactériocines de classe II chez Streptococcus salivarius

Details

Supervisors

Hols, Pascal

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire, à finalité spécialisée: biotechnologie

Abstract

Face au problème toujours plus important de la résistance aux antibiotiques, il devient urgent pour le monde médical de trouver une alternative. Plusieurs pistes sont donc étudiées à travers le monde. L’une de ces pistes, à laquelle s’intéresse l’équipe du Professeur Pascal Hols, est l’utilisation de bactériocines. Ces derniers sont des peptides antimicrobiens qui peuvent être synthétisés par une bactérie en réponse à une molécule inductrice dans le milieu extracellulaire ou à des conditions de stress. Au cours de ce mémoire, nous nous sommes intéressés aux bactériocines de classe II produites par Streptococcus salivarius, une bactérie commensale de la cavité buccale, des voies aériennes supérieures et de l’intestin grêle. Ces bactériocines sont de courts peptides linéaires, généralement non modifiés, qui ciblent des bactéries à Gram positif. Avant le début de ce travail, un crible bio-informatique a permis d’identifier des bactériocines encore inconnues produites par S. salivarius. Ce crible a été effectué en utilisant des caractéristiques communes des bactériocines chez cette espèce, comme la régulation de la production des bactériocines via la fixation du régulateur transcriptionnel ComR sur une séquence consensus appelée la ComR-Box. Cette analyse a permis de mettre en évidence 23 séquences, nommées de Ssa1 à Ssa20. L’objectif principal de ce mémoire était d’étudier les activités de ces bactériocines nouvellement découvertes, ainsi qu’élucider les mécanismes d’inhibition en identifiant les récepteurs membranaires ciblés chez les bactéries sensibles. Premièrement, nous avons étudié l’activité de ces potentielles nouvelles bactériocines, ainsi que leur spectre d’action. Des tests d’activité de bactériocines produites in vitro ont montré que neuf de ces bactériocines sont actives contre au moins l’une des dix souches bactériennes testées. De plus, sept autres bactériocines étaient actives en combinaison avec une deuxième bactériocine avec laquelle elles agissent en synergie. Au total, ce sont 16 bactériocines sur les 23 qui sont actives. De plus, des tests d’activité in vivo ont montré l’importance du promoteur natif dans l’expression génique des bactériocines. Deuxièmement, nous avons étudié le mode d’action des bactériocines produites par la souche modèle utilisée dans notre laboratoire, HSISS4. Cette étude s’est concentrée sur l’identification du récepteur nécessaire à l’ancrage des bactériocines. HSISS4 produit un cocktail composé de six bactériocines connues (BlpK, SlvV, SlvW, SlvX, SlvY et SlvZ), qui est capable d’inhiber la croissance d’espèces pathogènes hautement résistantes aux antibiotiques, tels que Staphylococcus aureus et Enterococcus faecium. Pour identifier les récepteurs ciblés par ces bactériocines, nous avons sélectionné des mutants de résistance à BlpK, qui est la bactériocine la plus active du cocktail. Nous avons ensuite effectué des analyses phénotypiques et génotypiques de ces mutants. En outre, nous avons montré une résistance croisée entre deux bactériocines, BlpK et SlvV, ce qui suggère que le mécanisme de résistance et éventuellement le récepteur ciblé sont communs aux deux. Enfin, des tests d’activité des bactériocines seules nous ont permis d’étudier leur spectre d’action et des tests d’activité des bactériocines en combinaison ont montré des effets de synergie entre BlpK-SlvW et SlvY-SlvZ. Finalement, toutes les données générées durant ce mémoire permettront une meilleure compréhension du mode d’action des bactériocines chez S. salivarius et ainsi l’utilisation des bactériocines à leur plein potentiel. De plus, certaines bactériocines étudiées, telles que BlpK et Ssa17.1, sont des peptides présentant un intérêt majeur pour leur capacité à inhiber des souches pathogènes clés telles que S. aureus et E. faecium. To address the growing issue of antibiotic resistance, an alternative is urgently needed for the medical world. Several options are now being studied around the globe. One of those options, in which the team of Professor Pascal Hols is interested, is the use of bacteriocins. Those are antimicrobial peptides that could be synthesized by bacteria in response to an extracellular inducing molecule or stress conditions. During this thesis, we studied class II bacteriocins produced by Streptococcus salivarius, which is a commensal bacterium of the oral cavity, upper airways and small intestine. Those bacteriocins are short linear peptides, generally unmodified, and target Gram-positive bacteria. Before starting this project, a bioinformatic screening was carried out to identify undiscovered bacteriocins produced by S. salivarius. This was achieved by using common characteristics of bacteriocins in this species, such as the regulation of bacteriocin production. One of those characteristics is the presence of a consensus sequence called the ComR-Box, which is bound by the transcriptional regulator ComR. This analysis highlighted 23 sequences, named from Ssa1 to Ssa20. The main goal of this work was to investigate the activity of those newly identified bacteriocins and to shed light on the mechanism of inhibition by the identification of cell-envelope receptors in sensitive bacterial species. Firstly, we investigated the potential activity of the novel bacteriocins, as well as their spectrum of action. Activity tests of bacteriocins produced in vitro showed that nine out of the 23 bacteriocins have an antimicrobial activity against at least one of the ten bacterial strains tested. Moreover, seven more were active when combined with another bacteriocin and showed a synergic effect, which brings a total of 16 active bacteriocins out of 23. In addition, in vivo activity tests showed the importance of the native promoter for bacteriocin gene expression. Secondly, we investigated the mode of action of the bacteriocins produced by a specific strain, HSISS4. This strain is the model strain used in our laboratory. The study was focused on the identification of the targeted receptor used by the bacteriocins to anchor themselves to the membrane. HSISS4 produces a cocktail of six known bacteriocins (BlpK, SlvV, SlvW, SlvX, SlvY and SlvZ), which can inhibit the growth of pathogenic species. Some of them are highly resistant to antibiotics, such as Staphylococcus aureus or Enterococcus faecium. In order to identify the targeted receptors, we selected resistant mutants to BlpK, which is the most active bacteriocin in the cocktail. We then performed phenotypic and genotypic analyzes of these mutants. Moreover, we proved the cross-resistance between two bacteriocins: BlpK and SlvV. Those experiments suggest that the resistance mechanism, and eventually the targeted receptor, are common between these two bacteriocins. Finally, activity tests of bacteriocins alone allowed us to study their spectrum of action and activity tests of the bacteriocins in combination with each other allowed us to study the synergic effect of BlpK-SlvW and SlvY-SlvZ. Ultimately, all the data generated during this Master’s thesis project will allow a better understanding of bacteriocins’ mode of action in S. salivarius, as well as to highlight their full potential. Additionally, some of the studied bacteriocins, such as BlpK and Ssa17.1, are peptides of major interest because of their activity against key pathogenic species, like S. aureus and E. faecium.