Etude des domaines fonctionnels impliqués dans la catalyse et la formation de complexes nucléoprotéiques chez la transposase de Tn4430

Details

Supervisors

Hallet, Bernard

Faculty

Faculté des sciences

Degree label

Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire

Abstract

Within a host cell, a "transposon" is a particular DNA sequence that can be moved or copied by insertion into a target DNA molecule during a process called transposition. This reaction takes place in the transpososome, a nucleoproteic complex which includes the transposon ends, the target DNA and the protein responsible for transposition : the transposase. Amongst the different transposon types, the Tn3 family of replicative transposons has a significant impact on living organisms because of its implication in the spread of antibiotics resistances in bacteria. Despite this, the mechanisms underlying Tn3 transposition and, in particular, the functional organisation of its transposase and the architecture of its transpososome are still poorly understood. During the past decade, the Tn4430 transposon has been used as a model to investigate Tn3 family transposition and has yielded some valuable insight into the different steps involved in the process. In order to perform transposition, the transposase (TnpA) has to reach an activated state to specifically bind both transposon ends forming a "Paired End Complex" (PEC) inside which the ends are cleaved. The transposase then has to contact a target sequence where it inserts the transposon. During this step, a mechanism of repulsion called "immunity" also mediated by TnpA prevents multiple insertions into the same locus. In a previous work attempting to link these activites to particular functional domains of TnpA, a library of TnpA mutant was built through pentapetide scanning mutagenisis. The pentapeptidomutants where then characterized through in vivo and in vitro essays for their ability to perform transposition, bind the transposon ends and bind the target. In this work we complete the study of these pentapeptidomutants by testing their catalytic activity in vitro and comparing it to their profile of nucleoproteic complex formation. We compare these activities to those of the previously described TnpAWT and to some deregulated mutants that show higher PEC formation and enhanced catalytic activity. Au sein d'une cellule hôte, un "transposon" est une séquence d'ADN déterminée qui est susceptible d'être déplacée ou copiée et inséré dans une molécule d'ADN cible par transposition. Cette réaction à lieu dans le transpososome, un complexe nucléoprotéique qui contient les extrémités du transposons, la cible et la protéine responsable de la transposition : la transposase. Parmis les différentes classes de transposons, la famille des transposons réplicatif réprésentée par Tn3 a un impact majeur sur le monde vivant de par son rôle dans la dissémination de résistances antibiotiques chez les bactéries. Malgré cela, les méchanismes régissant la transposition de Tn3 et, en particulier, son organisation fonctionnelle et l'architecture de son transpososome sont mal connus. Ces dernières années, le transposon Tn4430 a été utilisé comme modèle pour étudier la transposition chez la famille de Tn3 et a permis des avancées significatives dans la compréhension de son mécanisme. Lors de la transposition, la transposase (TnpA) doit atteindre un état actif pour lier spécifiquement les extrémités du transposon formant ainsi un Paired End Complex (PEC) dans lequel les extrémités sont coupées. TnpA contacte également la cible dans laquelle elle procède au transfert. Durant cette étape, un mécanisme de répulsion appelé "immunité" également médié par la TnpA, empêche les insertions multiples dans un même locus. Pour tenter de relier ces activités à des domaines fonctionnels de la TnpA, un précédent travail a mené une approche de mutagénèse par balayage via la technique de pentapeptidogénèse. Des test in vivo et in vitro ont ensuite permis de caractériser ces mutants pour leur activité de transposition et de liaison aux extrémités et à la cible. Dans ce travail nous avons complété l'étude de ces pentapeptidomutants en testant leur activité catalytique in vitro et en la comparant à leur profil de formation de complexe nucléoprotéique. Nous avons comparé ces activités à celles de la TnpAWT et à celles de deux mutants dérégulés montrant un formation de PEC et une activité catalytique accrue.