Adsorption-facilitating enzymes in phage Deep-Blue

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Supervisors

Mahillon, Jacques

Faculty

Faculté des sciences

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Master [120] en biochimie et biologie moléculaire et cellulaire

Abstract

Bacteriophages or phages are bacterial viruses for whom the interest has exponentially reemerged in the last decades due to their interesting antimicrobial properties. Thus, understanding how these viruses prey on their specific hosts is essential. Phage adsorption into their bacterial host is a critical step for triggering infection and requires the specific interaction between phage receptor-binding protein(s) (RBPs) and receptors on the bacterial surface. This adsorption process is often helped by structurally-encoded enzymes, namely depolymerases and ectolysins. Phage-encoded depolymerases are able to facilitate the adsorption process by cleaving exopolysaccharides or capsular polysaccharides that may be exhibited at the bacterial surface. Ectolysins are peptidoglycan (PG)-degrading enzymes whose main role is to facilitate cell wall crossing and tail extension without compromising host cell integrity. This work aimed to identify such antibacterial proteins involved in the adsorption of phage Deep-Blue, a tailed phage belonging to the Herelleviridae family and preying on the Bacillus cereus group. An in-depth bioinformatic analysis of the region encoding structural proteins of Deep-Blue’s tail retained four ectolysin and two depolymerase candidates. The putative ectolysins gp189, gp191, gp182 and gp195 were investigated since they contained PG-degradation associated domains such as NlpC/P60 domain for gp189 and gp182. The two putative depolymerases, gp222 and gp223, located outside the structural region, were retained for their consistent matches with sugar-binding and polysaccharide degrading associated hits like a Pectate lyase domain in gp223. All candidates, including truncated versions of gp189 (gp189_lyt) and gp191 (gp191_1000) to facilitate purification, were cloned in Escherichia coli. However, production and purification were only achieved for gp189, gp191_1000, gp222 and gp223. The truncated version of gp189, gp189_lyt, turned out to be lethal for the expression strain and further investigation is needed to determine the cause. Purified protein candidates were tested to assess their activity. For depolymerases, gp222 and gp223 were spotted on sensitive bacterial lawns and were expected to produce a degradation halo, the hallmark of depolymerase activity. Unfortunately, no clearing of the bacterial lawns was ever observed and thus, a depolymerase function could not be attributed to any of the tested candidates. Regarding ectolysins, turbidity reduction assays were conducted where only gp189 displayed consistent lytic activity on all sensitive strains tested. Up to 44.4 % of growth inhibition was detected on the B. weihenstephanensis Si0239 sensitive strain. These results strongly suggest gp189 to be Deep-Blue's ectolysin. Additionally, the lysis from without phenomenon, in which a high virion concentration causes bacterial lysis but no phage progeny production, was also investigated since it constitutes an indicator of ectolysin activity. Adsorption tests revealed that this ectolysin-driven phenomenon was possible both in strains equipped and lacking the RBP receptor, which indicates that specific adsorption onto the bacterial surface is not essential for ectolysin activity. Finally, given that purification by ultracentrifugation in a CsCl gradient could not be achieved, it is possible that Deep-Blue may not be stable in CsCl or viable after ultracentrifugation as it has been the case for other phages. Les bactériophages ou phages sont des virus bactériens pour lesquels l'intérêt a refait surface de manière exponentielle au cours des dernières décennies en raison de leurs propriétés antimicrobiennes. Il est donc essentiel de comprendre comment ces virus s'attaquent à leurs hôtes spécifiques pour mieux exploiter leur potentiel. L'adsorption des phages sur leur hôte bactérien est une étape critique pour déclencher l'infection et nécessite une interaction spécifique entre la ou les receptor binding protein des phages (RBP) et les récepteurs à la surface de la bactérie. Ce processus d'adsorption est souvent facilité par deux types d’enzymes structurelles, les dépolymérases et les ectolysines. Les dépolymérases sont capables de faciliter le processus d'adsorption en clivant les exo polysaccharides ou les polysaccharides capsulaires pouvant se trouver à la surface de la bactérie. Les ectolysines sont des enzymes dégradant le peptidoglycane (PG) dont le rôle principal est de faciliter la traversé des parois cellulaires et l'extension de la queue du phage sans compromettre l'intégrité de la cellule hôte. Ce travail vise à identifier les protéines impliquées dans les premières étapes de l'adsorption du phage Deep-Blue, un phage appartenant à la famille des Herelleviridae et infectant les membres du groupe Bacillus cereus. Une analyse bio-informatique approfondie de la région codant pour les protéines structurelles de la queue de Deep-Blue a permis de sélectionner quatre candidats pour l’ectolysine et deux candidats pour la dépolymérase. Les ectolysines potentielles, gp189, gp191, gp182 et gp195 ont été étudiées car elles contiennent des domaines associés à la dégradation du PG tels que le domaine NlpC/P60 pour gp189 et la gp182. Les deux dépolymérases potentielles, gp222 et gp223, situées en dehors de la région structurale de la queue, ont été retenues pour leurs homologie avec domaines capables de lier et de dégradation des polysaccharides comme un domaine de Pectate lyase dans gp223. Tous les candidats, y compris les versions tronquées de la gp189 (gp189_lyt) et de la gp191 (gp191_1000), ont été clonés dans Escherichia coli. Cependant, la production et la purification n'ont pu être réalisées que pour gp189, gp191_1000, gp222 et gp223. La version tronquée de la gp189, gp189_lyt, s'est avérée létale pour la souche d'expression et des recherches supplémentaires sont nécessaires pour en déterminer la cause. Les candidats purifiés ont été testées pour évaluer leur activité. Pour les dépolymérases, les protéines ont été déposés sur des couches de bactéries sensibles et devaient produire un halo de dégradation, la signature de l'activité de la dépolymérase. Malheureusement, aucun halo des couches bactériennes n'a jamais été observé et, par conséquent, une fonction dépolymérase n'a pu être attribuée à aucun des candidats testés. En ce qui concerne les ectolysines, des tests de réduction de la turbidité ont été réalisés, dans lesquels seule gp189 a montré une activité lytique constante sur toutes les souches sensibles testées. Jusqu'à 44,4 % d'inhibition de la croissance a été détectée sur la souche sensible Si0239 de B. weihenstephanensis. Ces résultats suggèrent fortement que gp189 est l'ectolysine de Deep-Blue. En outre, le phénomène de Lysis-from-without, dans laquelle une concentration élevée de phages provoque une lyse bactérienne prématurée sans production de nouveaux virions, a également été étudiée car elle constitue l’indicateur d'une activité ectolysine. Des tests d'adsorption ont permis de démontrer que ce phénomène, lié aux ectolysine, a été signalé à la fois dans les souches pourvues et dépourvues du récepteur au RBP viral, ce qui indique que l’adsorption spécifique sur la surface bactérienne n'est pas essentielle pour l'activité de l'ectolysine. Enfin, étant donné que la purification par ultracentrifugation dans un gradient de CsCl n'a pas pu être réalisée, il est possible que Deep-Blue ne soit pas compatible avec cette technique comme cela a été le cas pour de nombreux autres phages.