Rôle des enzymes G6PDH, IDH1 et ME1 dans l’augmentation du NADPH cytosolique dans les cellules INS-1 832/13 stimulées par le glucose

Details

Supervisors

Jonas, Jean-Christophe

Faculty

Faculté de pharmacie et des sciences biomédicales

Degree label

Master [120] en sciences biomédicales, à finalité approfondie

Abstract

frLa sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS) repose sur une voie de déclenchement dépendante du Ca²⁺ et une voie d’amplification qui augmente l’efficacité du Ca²⁺ sur l’exocytose. Le NADPH cytosolique est un des facteurs de couplage métabolique qui pourrait être responsable de ce phénomène en maintenant un environnement réducteur nécessaire à l’activité de l’effecteur de l’exocytose SENP1. Le laboratoire du Professeur J-C. Jonas a montré, grâce aux sondes fluorescentes iNap et SoNar, que le NADPH et le rapport NADH/NAD+ cytosoliques et mitochondriaux augmentent dans des tapis de cellules INS-1 832/13 stimulées par des concentrations croissantes de glucose. Cependant, les résultats obtenus étaient très variables et n’ont pas permis d’évaluer la contribution relative des enzymes IDH1, ME1 et G6PDH (enzymes responsables de la synthèse du NAPDH cytosolique) sur le NAPDH cytosolique en tant que facteur de couplage. L’objectif de mon mémoire était : 1) de mettre en place un modèle tridimensionnel de pseudo-îlots de cellules INS-1 832/13, plus homogène et reproductible que les tapis de cellules 2D tout en restant compatible avec la transfection siRNA et l’expression de sondes fluorescentes ; 2) de caractériser, dans ce modèle, la dynamique du NADPH et du NADH cytosoliques et mitochondriaux, l’autofluorescence NAD(P)H, la concentration cytosolique de Ca²⁺ et la sécrétion d’insuline ; 3) d’évaluer l’impact de la diminution de l’expression des enzymes productrices du NADPH cytosolique. Les résultats obtenus montrent que les pseudo-îlots non transfectés présentent un profil comparable à celui observé dans les tapis de cellules, tout en offrant des résultats plus reproductibles. Après l’inhibition de ME1 validée par RT-qPCR et Western blot, le NADPH cytosolique et le Ca²⁺ ne diffèrent pas significativement du contrôle. En revanche, le NADPH mitochondrial est fortement diminué et perd sa réponse au glucose, tandis que l’autofluorescence NAD(P)H est augmentée à bas glucose. Fonctionnellement, siME1 réduit la sécrétion d’insuline à haut glucose et sa réponse au glucose sans modifier le contenu en insuline, y compris en conditions dépolarisantes (KCl + diazoxide), ce qui suggère une atteinte de la voie d’amplification. Enfin, un test de mort cellulaire indique également une augmentation de l’apoptose sous siME1. En conclusion, le modèle 3D établi est adapté à l’étude intégrée de l’état redox, du Ca²⁺ et de la sécrétion, et les données suggèrent que la diminution de ME1 altère l’amplification de la GSIS, associée à une baisse du NADPH mitochondrial et à une augmentation de la mortalité cellulaire.