Etude du rôle d’un variant (c.1183C>T, p.Arg395Trp) dans le gène NT5E sur le compartiment vasculaire de la sclérose systémique

Details

Supervisors

Limaye, Nisha

Faculty

Faculté de pharmacie et des sciences biomédicales

Degree label

Master [120] en sciences biomédicales, à finalité approfondie

Abstract

frLa sclérose systémique (SSc) est une maladie auto-immune rare impactant le système vasculaire, le système immunitaire et le tissu conjonctif. Bien que majoritairement sporadique, une histoire familiale est observée dans moins de 2% des cas de SSc. Le laboratoire a réalisé un Whole Exome Sequencing (WES) sur une cohorte extrêmement rare composée de six familles de SSc. Ce séquençage a permis d’identifier un variant hétérozygote rare dans le gène NT5E (c.1183C>T, p.Arg395Trp), au sein d'une famille dont les deux membres malades sont atteints de la forme la plus grave de SSc, avec fibrose diffuse. Le gène NT5E code pour la protéine membranaire homodimérique CD73, déphosphorylant l’adénosine monophosphate extracellulaire en adénosine et phosphate inorganique. Principalement grâce à son activité enzymatique, CD73 joue un rôle immunosuppressif primordial, mais également dans la régulation de l’angiogenèse et de la fibrose. L’objectif de ce projet est d’étudier in vitro l’impact potentiel du variant dans NT5E sur la composante vasculaire de la maladie. Le modèle cellulaire utilisé est une lignée de cellules endothéliales microvasculaires humaines (HMEC-1). Cette lignée, exprimant de manière endogène NT5E, a été transduite avec l’acide désoxyribonucléique complémentaire (ADNc) variant de NT5E, afin d'obtenir une lignée hétérozygote pour le variant d'intérêt. Une lignée contrôle Wild-Type (WT) a également été générée par transduction de l’ADNc WT de NT5E, ainsi qu’une lignée Knock-Out pour le gène NT5E, grâce à la technique du CRISPR/Cas9. La séquence et l’expression de NT5E des différentes lignées cellulaires créées ont été vérifiées, avant que ces lignées soient comparées quant à leur morphologie, prolifération, viabilité, et mort cellulaire. Les premières données suggèrent que ces paramètres ne sont pas impactés par le variant d’intérêt. Nous avons ensuite mesuré l’activité enzymatique de CD73 à l’aide d’un test colorimétrique. Nous avons pu démontrer que la lignée HMEC-1 hétérozygote pour le variant d’intérêt présente une diminution de près de 70% de l’activité enzymatique de CD73, suggérant un effet dominant négatif de ce variant. Des tests fonctionnels évaluant l’angiogenèse sont en cours. Parmi ceux-ci, un test mesurant la formation de tubes vasculaires semble montrer que le variant dans NT5E pourrait altérer la formation de réseaux vasculaires. En conclusion, les résultats préliminaires de ce travail semblent indiquer que le variant d’intérêt dans NT5E (c.1183C>T, p.Arg395Trp) identifié dans une famille SSc impacterait l'activité enzymatique de CD73, et pourrait affecter les fonctions des cellules endothéliales.