Impact des mutations de la calréticuline sur la stabilité des glycoprotéines clientes et la modulation du répertoire peptidique MHC-I

Details

Supervisors

Vigneron, Nathalie

Faculty

Faculté de pharmacie et des sciences biomédicales

Degree label

Master [120] en sciences biomédicales, à finalité approfondie

Abstract

frLes néoplasmes myéloprolifératifs sont associés dans un certain nombre de cas à des mutations de la calréticuline (CALR), entraînant l’expression de formes tronquées de cette protéine. Ces mutations altèrent les fonctions classiques de CALR, notamment son rôle de chaperonne dans le repliement de protéines glycosylées et son implication dans le chargement des peptides sur les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) de classe I. Des travaux antérieurs du laboratoire, basés sur l’analyse par spectrométrie de masse des peptides associés aux molécules HLA de classe I, ont montré un enrichissement du répertoire pour des peptides dérivés de protéines glycosylées lysosomales, en particulier la myélopéroxydase (MPO), la protéinase 3 (PRTN3), et la cathepsine G (CTSG), dans des cellules de néoplasme prolifératif MARIMO exprimant des formes mutées de la CALR. L'objectif principal de ce mémoire est de comprendre les mécanismes cellulaires menant à la génération des peptides qui se trouvent enrichis à la surface de ces cellules mutées pour la calréticuline. De manière intéressante, nos résultats montrent que ces trois protéines sont nettement moins abondantes dans les cellules exprimant une calréticuline mutée, suggérant qu’elles pourraient y être plus rapidement dégradées. De manière surprenante, l’inhibition du protéasome n’a qu’un impact limité sur la stabilité de ces protéines, indiquant que d’autres voies de dégradation indépendantes du protéasome pourraient être impliquées. Ces observations orientent l’étude vers l’analyse de la stabilité et de la dégradation de MPO, PRTN3 et CTSG dans différents contextes cellulaires, afin de mieux caractériser les voies impliquées. Nos résultats préliminaires montrent que l’inhibition de la dégradation lysosomale stabilise davantage MPO, PRTN3 et CTSG que l’inhibition du protéasome, suggérant que les voies lysosomales pourraient jouer un rôle majeur dans la dégradation de ces protéines et dans la génération des peptides qui en dérivent sur les molécules HLA de classe I. Pour le second objectif de ce mémoire, nous voudrions étudier si l’enrichissement en peptides dérivés de protéines lysosomales dans les cellules Marimo peut s’étendre à un autre modèle cellulaire. Pour cela, nous avons effectué un knock-out du gène CALR dans la lignée myéloïde NB4 en utilisant la méthode CRISPR/Cas9. Nous espérons ainsi pouvoir comparer les résultats d’immunopeptidomique qui seront obtenus à partir de cette lignée avec ceux des cellules Marimo, afin d’évaluer si l’enrichissement en peptides originaires de glycoprotéines lysosomales constitue une signature générale de la perte de fonction de la calréticuline. Pour ce faire, nous avons mis au point la méthodologie en comparant différentes stratégies d’acquisition en spectrométrie de masse, soit la Data-Dependent Acquisition (DDA) et la Data-Independent Acquisition (DIA), appliquées à l’analyse du peptidome MHC-I. Pour cela, une analyse immunopeptidomique a été réalisée sur la lignée NB4, permettant d’évaluer la performance, la couverture et la sensibilité de l’approche DIA par rapport à l’approche DDA précédemment utilisée au laboratoire.